CHROMATOGRAPHE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)
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La CLHP est un spécialiste de premier ordre dans la détermination de l'identité et de la quantité d'éléments et de molécules, comme l'activité d'une plante, le produit d'une réaction enzymatique ou toute molécule qui absorbe la lumière ou qui peut être rendue chromophore (capable d'absorber/transmettre la lumière). La CLHP est très spécifique dans la mesure où elle permet de déterminer avec certitude ce qu'est une substance et quelle est sa quantité exacte.
La HPLC fonctionne en injectant automatiquement un petit volume d'échantillon liquide dans une colonne remplie de particules 1⁄20 L'échantillon liquide est d'une épaisseur équivalente à celle d'une feuille de papier blanc. L'échantillon liquide est forcé à travers la colonne par de puissantes micropompes. Le détecteur envoie un signal numérique à l'ordinateur, où un logiciel spécialisé est utilisé pour identifier et déterminer la quantité des composants séparés.
Nous l'utilisons régulièrement pour analyser la composition de composés présents dans des mélanges complexes, tels que les vitamines hydrosolubles et liposolubles. Nous utilisons également la HPLC pour analyser une grande variété de matières végétales, par exemple l'astragale, le pissenlit et le trèfle rouge.
Il s'agit d'un chromatogramme liquide typique de vitamines hydrosolubles ; ceux-ci sont appelés pics chromatographiques et chacun représente un composé séparé.
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La spectrométrie de masse HPLC comme outil d'analyse
La chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS) est un outil idéal pour l'identification, la quantification et l'analyse de masse des composants, souvent utilisée pour déterminer la composition chimique et la pureté des produits chimiques. La HPLC-MS présente une sensibilité élevée et est optimale pour effectuer des analyses quantitatives précises et reproductibles. Cette méthode est idéale pour détecter les composés thermolabiles, tels que les protéines et les vitamines dans les produits alimentaires. Contaminants alimentaires sont également souvent quantifiés à l'aide de la HPLC-MS.
En HPLC-MS, les deux techniques (HPLC et MS) sont reliées par une interface qui transfère les composants séparés de la colonne de chromatographie liquide vers la source d'ions du spectromètre de masse. Une interface est nécessaire car la HPLC fonctionne à haute pression et le système MS a un vide poussé.
La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) comprend une phase mobile et une phase stationnaire, toutes deux pouvant être modifiées pour s'adapter à la matrice de l'échantillon et aux propriétés souhaitées à déterminer. En général, la phase mobile est ajustée pour s'adapter à l'échantillon et la phase stationnaire est ajustée pour bien fonctionner avec la phase mobile. Le degré de séparation du composé est basé sur l'affinité du composé pour la phase mobile.
Les méthodes HPLC peuvent être divisées en deux catégories principales en fonction des propriétés des phases stationnaires et mobiles. La combinaison d'une phase stationnaire polaire et d'une phase mobile non polaire est appelée « chromatographie en phase normale » et l'inverse, la combinaison d'une phase stationnaire non polaire et d'une phase mobile polaire est appelée « chromatographie en phase inverse ».
HPLC en phase normale
En HPLC en phase normale, la colonne est généralement remplie de particules de silice. La silice est polaire et se lie aux molécules polaires dans la phase mobile. Cela signifie que les composés les moins polaires éluent en premier et les composés les plus polaires en dernier. La HPLC en phase normale convient aux composés hautement hydrophobes ou hydrophiles, aux composés qui ne sont pas solubles dans l'eau et aux composés qui peuvent se décomposer dans l'eau. L'utilisation idéale de la HPLC en phase normale est la séparation des isomères.
HPLC en phase inverse
En HPLC en phase inverse, la phase stationnaire est généralement constituée de silice C8 ou C18 (silice dérivée avec des chaînes alkyles). Contrairement à la HPLC en phase normale, en HPLC en phase inverse, les composés les plus polaires éluent en premier et les composés les moins polaires en dernier. La phase stationnaire peut être composée de différents solides pour répondre à différents besoins.
Combinaison de la HPLC et de la spectrométrie de masse
Une fois les composés séparés par HPLC, ils sont identifiés et leur contenu est déterminé par spectrométrie de masse (MS), qui crée un spectre de masse unique pour chaque composé. Dans la spectrométrie de masse, les composés et leurs fragments sont ionisés par ionisation électronique ou chimique. L'échantillon est ensuite accéléré dans un analyseur de masse, qui comprend soit un quadripôle, soit un piège à ions, et les ions sont identifiés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).
Il est également possible de combiner la HPLC avec d'autres détecteurs que le spectromètre de masse. Analyse HPLC-DAD, par exemple, un détecteur à barrette de diodes est utilisé à la place. Le choix du détecteur le plus approprié dépend de l'analyte et de l'objectif de l'analyse. En général, la HPLC-MS est plus adaptée à l'identification des composants inconnus, tandis que le détecteur DAD fonctionne bien pour quantifier les composants connus.
Échantillons et préparation des échantillons
La méthode HPLC-MS est adaptée aux échantillons sous forme liquide. Pour les matrices d'échantillons solides, une préparation de l'échantillon est nécessaire. Les composés à doser doivent être extraits dans un solvant et filtrés avant l'analyse.
